在众多外泌体适配体筛选技术中，磁珠 - SELEX（MB-SELEX）凭借 “富集效率高、操作简便、适配复杂体系” 的核心优势，成为目前应用最广泛的经典方法之一。其核心逻辑是利用磁珠（MB）作为固相载体，通过表面修饰的官能团固定靶标（外泌体或其特征蛋白）或核酸文库，结合磁场实现 “特异性结合序列与游离序列” 的快速分离，经多轮迭代筛选获得高亲和力、高特异性的外泌体适配体。本文将从技术原理、核心优势与应用案例、现存挑战三方面，系统解析 MB-SELEX 在中泌体适配体筛选中的价值。

一、技术原理：磁珠载体的 “结构设计” 与筛选流程的 “精准把控”

MB-SELEX 的高效性源于磁珠的特殊结构与严谨的筛选流程设计，二者共同确保特异性适配体的有效富集：

1. 磁珠载体的结构与功能特性

磁珠并非简单的 “磁性颗粒”，而是具有多层结构的功能载体，其设计直接决定筛选效率：

核心层：由聚苯乙烯通过自由基乳液聚合形成，提供稳定的颗粒骨架；功能修饰层：核心外层包覆多层材料，一方面增强磁性（确保快速响应外部磁场），另一方面修饰特定官能团 —— 常见的有环氧基、羧基、氨基、链霉亲和素等，可通过 “共价结合”（如羧基与氨基的缩合反应）或 “生物亲和作用”（如链霉亲和素与生物素的特异性结合），将外泌体、外泌体特征蛋白或核酸文库固定在磁珠表面；理化特性：磁珠在水溶液中分散性好、亲水性强，既避免颗粒团聚影响结合效率，又能在施加磁场后快速沉降，实现 “结合复合物与游离成分” 的高效分离（通常几秒内完成）。

2. 筛选的核心流程：“负筛 - 正筛 - 洗脱 - 扩增” 的多轮迭代

MB-SELEX 的筛选流程需严格把控每一步，以减少非特异性序列干扰，确保适配体的富集质量，典型流程如下：

靶标固定：根据研究目标，将外泌体（完整外泌体或疾病特异性外泌体）或其特征蛋白（如 HER2、EpCAM）通过磁珠表面的官能团固定，形成 “磁珠 - 靶标复合物”；负筛（反筛）：先将核酸文库与 “非靶标磁珠复合物”（如固定正常细胞外泌体、牛血清白蛋白 BSA 的磁珠）孵育，去除能与非靶标结合的非特异性序列 —— 这一步是降低假阳性的关键，可显著提升后续筛选的特异性；正筛：将经过负筛的核酸文库与 “磁珠 - 靶标复合物” 孵育，让文库中的特异性序列与靶标结合；磁场分离与洗脱：施加外部磁场，使 “磁珠 - 靶标 - 适配体复合物” 沉降，弃去上清中的游离序列；再通过改变缓冲液 pH、离子强度或温度，将结合的特异性序列从复合物上洗脱下来；扩增与测序：将洗脱的特异性序列通过 PCR（DNA 文库）或 RT-PCR（RNA 文库）扩增，作为下一轮筛选的文库；通常经过 8~24 轮筛选后，对最终富集的序列进行高通量测序，鉴定出高亲和力的适配体。

二、核心优势与应用案例：从 “靶蛋白筛选” 到 “临床样本适配”

MB-SELEX 的核心优势在于 “适配复杂体系、易引入负筛、富集效率高”，这些优势使其在不同疾病相关外泌体适配体筛选中均有出色表现，以下为典型应用案例：

1. 优势 1：易引入负筛，提升适配体特异性

MB-SELEX 可通过 “多轮负筛” 排除非特异性序列，尤其适合外泌体这类 “高异质性、易受基质干扰” 的靶标。案例：乳腺癌 HER2 阳性外泌体适配体筛选Niazi 团队为获得靶向乳腺癌外泌体 HER2 蛋白的适配体，设计了 “先负筛再正筛” 的流程：

第一步负筛：将核酸文库与 “磁珠 - BSA 复合物” 孵育 1 轮，去除能与 BSA（常见干扰蛋白）结合的非特异性序列；第二步正筛：以 “磁珠 - HER2 蛋白复合物” 为靶标，经过 12 轮筛选，最终获得 7 条候选 DNA 适配体；

结果：其中适配体 H2 的出现频次最高，KD 值约为 270 nmol/L（KD 值越小，亲和力越高），可特异性结合乳腺癌细胞来源的 HER2 阳性外泌体，对正常细胞外泌体的结合率低于 5%，证明其高特异性。

2. 优势 2：适配完整外泌体筛选，保留靶标天然构象

相比固定单一蛋白，MB-SELEX 可直接固定完整外泌体，避免蛋白纯化过程中构象改变，筛选出的适配体更贴近生理状态下的结合特性。案例：乳腺癌患者血清外泌体适配体筛选Esposito 团队采用 “负筛 - 正筛交替循环” 策略，针对乳腺癌（BC）患者血清外泌体筛选适配体：

负筛：用 “磁珠 - 正常乳腺上皮细胞外泌体复合物” 孵育，去除结合正常外泌体的序列；

正筛：用 “磁珠 - BC 细胞外泌体复合物” 孵育，富集特异性序列；

结果：仅经过 8 轮筛选，便获得适配体 ex-50.T，其KD 值约为 0.8 nmol/L（高亲和力），靶点为 BC 外泌体的 HER2 蛋白；更重要的是，该适配体可特异性识别 BC 患者血清中的外泌体，对健康人血清外泌体的识别率不足 10%，为乳腺癌液体活检提供了潜在工具。

3. 优势 3：可结合序列优化，进一步提升适配体性能

MB-SELEX 筛选出的适配体可通过截短、突变等优化，增强亲和力与实用性。案例：EpCAM 阳性外泌体适配体 SYL3C 的开发Song 团队以 “磁珠 - EpCAM 蛋白复合物” 为靶标，经过 12 轮筛选获得适配体 SYL3；为提升其亲和力，对序列进行截短处理：

优化后得到短序列 SYL3C，其对乳腺癌 MDA-MB-231 细胞外泌体的KD 值为 (38±9) nmol/L，对胃癌 Kato Ⅲ 细胞外泌体的 KD 值为 (67±8) nmol/L，相比原序列 SYL3 亲和力提升 2~2.5 倍；

功能验证：SYL3C 可从 “Kato Ⅲ（EpCAM 阳性）与 Ramos（EpCAM 阴性）混合细胞” 的外泌体中，特异性捕获 EpCAM 阳性外泌体，捕获效率达 63%，证明其在复杂外泌体混合物中精准识别的能力。

4. 拓展应用：适配体介导的靶向药物递送

MB-SELEX 筛选的适配体不仅可用于外泌体检测，还能作为靶向载体实现肿瘤治疗。案例：前列腺癌 PSMA 外泌体适配体的药物递送应用Boyacioglu 团队以 “磁珠 - 前列腺癌细胞外泌体 PSMA 蛋白复合物” 为靶标，经过 10 轮正筛 + 2 轮反筛（用不含 PSMA 的磁珠去除非特异性序列），获得适配体 SZTI01；基于该适配体构建 “pH 敏感型二聚体 DNA 适配体复合物（DAC）”，负载抗癌药物多柔比星（Dox）：

作用机制：DAC 可特异性结合 PSMA 阳性细胞，在肿瘤微环境的酸性条件下释放 Dox，进入细胞核杀伤肿瘤细胞；

效果：PSMA 阳性细胞对 DAC 的吸收量是阴性细胞的 8 倍以上，显著降低药物的系统毒性，同时该适配体对前列腺癌外泌体的特异性识别，也为其作为诊断工具奠定基础。

三、现存挑战：影响筛选效率的 “关键瓶颈” 与改进方向

尽管 MB-SELEX 优势显著，但在针对外泌体的筛选中，仍存在 5 类关键挑战，需通过技术优化进一步突破：

1. 外泌体固定密度的 “精准控制难题”

完整外泌体固定在磁珠表面时，密度难以均匀把控：

密度过高：外泌体在磁珠表面拥挤堆叠，可能遮挡特征蛋白的结合位点，导致适配体无法有效结合；

密度过低：磁珠表面结合位点不足，特异性序列的富集效率下降，需增加筛选轮次才能获得足够量的适配体。改进方向：通过优化磁珠表面官能团密度（如减少羧基修饰量）、控制外泌体与磁珠的孵育比例，实现外泌体的单分散固定。

2. 外泌体表面蛋白的 “构象改变风险”

磁珠与外泌体的固定过程（如共价结合）可能导致外泌体表面特征蛋白的天然构象发生改变，使筛选出的适配体结合的是 “变性蛋白”，而非生理状态下的靶点 —— 这类适配体在后续体外检测或体内应用中，亲和力会显著下降。改进方向：优先采用 “非共价固定方式”（如链霉亲和素 - 生物素结合），减少对蛋白构象的影响；或在筛选后增加 “天然外泌体结合验证” 步骤，排除结合变性蛋白的适配体。

3. 洗脱过程中的 “外泌体破损问题”

洗脱特异性序列时，缓冲液 pH、离子强度的剧烈变化可能导致外泌体膜结构破损，释放内部蛋白或核酸 —— 这些成分会与核酸文库发生非特异性结合，增加后续筛选的背景干扰，降低筛选效率。改进方向：采用 “温和洗脱条件”（如小幅调整 pH 至 6.0~8.0，避免极端值），或选择外泌体特征蛋白作为靶标（而非完整外泌体），减少洗脱对靶标的破坏。

4. 磁珠理化性质的 “一致性要求”

磁珠的磁性强度、表面官能团修饰量、分散性等理化性质，直接影响靶标固定效率与磁场分离效果：若不同批次磁珠的修饰量差异大，会导致筛选重复性差；若磁珠分散性不佳，易团聚形成 “假阳性结合复合物”。改进方向：选择工业化量产的高均一性磁珠（如粒径偏差 < 5%），并在每批筛选前验证磁珠的结合效率（如通过 BSA 结合实验确认官能团活性）。

5. 磁珠表面的 “非特异性吸附干扰”

磁珠表面即使经过封闭（如 BSA 处理），仍可能与核酸文库中的某些序列发生非特异性吸附（如通过静电作用结合富含 G/C 的序列），这些序列会随多轮筛选富集，导致最终获得 “假阳性适配体”。改进方向：增加 “磁珠单独负筛” 步骤 —— 将核酸文库与未固定靶标的空白磁珠孵育，去除能结合磁珠本身的序列；或在筛选缓冲液中加入 competitor（如鲑鱼精 DNA），减少非特异性吸附。

泰克生物依托成熟的磁珠 - SELEX（MB-SELEX）技术平台，聚焦外泌体特征蛋白（如 HER2、EpCAM、PSMA）靶向适配体的开发，通过优化负筛流程与磁珠固定条件，获得高亲和力、高特异性的适配体工具，为外泌体的精准检测、肿瘤液体活检及靶向药物递送提供核心技术支撑。